Mit Beginn des Zweiten Weltkrieges 1939 wurde auch die Pfälzische Ludwigsbahn für den Munitions- und Truppentransport genutzt. In den ersten Kriegsjahren noch nicht von großer Bedeutung, gewann sie in den späteren Kriegsjahren mehr Bedeutung als eine der Zubringerstrecken zur Westfront an die französisch-deutsche Grenze.
Mit zunehmenden Kampfhandlungen nahmen auch die Zerstörungen der Anlagen der großen Stationen wie Mannheim, Ludwigshafen, Neustadt, Kaiserslautern, Homburg und Saarbrücken zu. So wurde durch einen Angriff die Brücke über den Rhein zwischen Ludwigshafen und Mannheim unbefahrbar, was den Nachschub an Munition und Soldaten für die Front und an Ressourcen für die zivile Bevölkerung erschwerte. Viele weitere Angriffe dieser Art folgten an anderen Orten und machten so die Pfälzische Ludwigsbahn, speziell als Zufuhrstrecke für die Westfront, annähernd unbefahrbar. Nur Vorortverkehr war noch möglich, und dies auch nur mit erheblichen Einschränkungen.
Darüberhinaus wurde auch die Pfälzische Ludwigsbahn zum Transport von KZ-Häftlingen und Kriegsgefangenen genutzt. Bekannt ist hier vor allem von der Philosphin Edith Stein, die 1942 mit einem Zug nach Auschwitz deportiert wurde, der die Pfälzische Ludwigsbahn nutzte. Im Bahnhof Schifferstadt erinnert heute eine Gedenktafel an ihr Schicksal (siehe Foto rechts).
Weiterhin wurde der Zollbahnhof Homburg (Saar) während des Krieges immer häufiger Ziel verschiedener Luftangriffe. Als Verschiebebahnhof für Material und Personal gleichermaßen war er für die Alliierten ein wichtiges Ziel entlang der Pfälzischen Ludwigsbahn. Die Zerstörungen, die der Krieg dort hinerließ, wurden nach Kriegsende nicht mehr behoben. Die noch intakten oder nur leicht beschädigten Gleisanlagen wurden so weit repariert, dass eine Nutzung wieder möglich war. Alle anderen Anlagen wurden abgebaut und als Rohstoff oder Reparationsgut verwendet.